严格使用一次性细胞培养瓶

　　一次性细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。HEPES是一种非离子缓冲液，在pH 7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。在这种培养条件下，一次性细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。

　　温馨提示：请严格按照此步骤操作，否则可能会出现一次性细胞培养瓶中细胞生长空白区域，即所谓的“生长空洞”。多数用户使用的不是的预包被一次性细胞培养瓶，而是普通的一次性细胞培养瓶或培养皿，其表面环境并不利于无血清培养环境下的间充质干细胞贴壁。37℃放置5-10分钟，可让培养基中的促贴壁物质更好地与一次性细胞培养瓶底部结合，使得间充质干细胞的贴壁能力增强，降低“生长空洞”出现的概率。

　　细胞消化：将一次性细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞*脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清)，混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80%以上，吸走培养基，加入5ml的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞*消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。